石蜡切片荧光tunel(绿光）实验
TUNEL(TdT-mediated DUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化物酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP第五二氨基联*胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞。由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。TUNEL细胞凋亡试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

1. 实验器材及试剂

1.1 实验器材

名称	厂家	型号
脱水机	DIAPATH	Donatello
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
病理切片机	上海徕卡仪器有限公司	RM2016
冻台	武汉俊杰电子有限公司	JB-L5
组织摊片机	浙江金华市科迪仪器设备有限公司	KD-P
烤箱	上海慧泰仪器制造有限公司	DHG-9140A
盖玻片	江苏世泰实验器材有限公司	10212432C
微波炉	格兰仕微波炉电器有限公司	P70D20TL-P4
脱色摇床	其林贝尔	Orbital Shaker TS-1
涡旋混合器	常州越新仪器制造有限公司	MIX-E
掌上离心机	大龙	D2012Plus
移液枪	吉尔森P型移液器	P2.P10.P20.P100.P200
组化笔	Japan
正置荧光显微镜	日本尼康	Nikon Eclipse C1
扫描仪	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
成像系统	日本尼康	Nikon DS-U3

1.2 主要实验试剂

试剂	厂家	货号	稀释比
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	100092183
环保型脱蜡液	武汉赛维尔生物	G1128
PBS 缓冲液	WKSUBIO	KGK0002
蛋白酶 K	金普诺安	GPK003001
DAPI	碧云天	C1002
抗荧光淬灭封片剂	碧云天	P0126
Tunel 试剂盒	Roche公司	11684817910

2.石蜡切片荧光tunel实验步骤
2.1 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ15min-环保型脱蜡液Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。(冬天应该适当延长脱蜡时间）
2.2 蛋白酶K修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育22min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(蛋白酶K工作液配置方法，原液：PBS=1:1000)
2.3 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(破膜液为0.1%triton. 配置方法，triron原液：PBS=1:1000)
2.4 室温平衡：切片稍甩干后在圈内滴加buffer覆盖组织，buffer常温孵育10min.
2.5加反应液：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量TDT酶 ：dUTP：buffer按1:5:50比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
2.6 DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
2.7 封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
2.8 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；488激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712 nm。）
3. 石蜡切片免疫荧光结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光

仅供科研用途，不可用于临床诊！