Lipofectamine 3000实验操作步骤

Lipofectamine 3000实验操作步骤如下:

一：细胞接种
 
转染前一天，将汇合度达80%-90%的细胞进行解离处理，用台盼蓝拒染法进行细胞计数，确保细胞活力>90% 。根据培养容器不同，接种相应数量的细胞，如24孔板的单个孔可加入500μL生长培养基，接种8.5×10^{4}个细胞，或接种1.1×10^{5}个细胞等，具体可参考实验优化结果 。
 
二：制备转染复合物 
 
1. 取两个无菌离心管，管1中加入25μL Opti - MEM I培养基，再加入1.5μL或2μL Lipofectamine 3000试剂，轻轻混匀。
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2. 管2中加入25μL Opti - MEM I培养基，加入0.5μL浓度为0.5-5μg/μL的DNA和1μL或0.5μL P3000试剂，吹吸混匀。
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3. 将管2溶液加入管1中，混匀，室温下孵育10-15min。
 
三：细胞转染 
 
将50μL制备好的复合物加入到细胞孔中，轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中，放回培养箱继续培养。
 
四：后续培养与检测 
 
转染后4-24h内可根据细胞状态更换为完全生长培养基，避免转染后4-6小时直接更换全量新鲜培养基，改为“梯度换液”——先加入1/2体积的新鲜完全培养基（含血清，无抗生素），静置1小时，再补加剩余1/2体积培养基。此举可缓慢降低试剂毒性，同时给细胞足够时间完成复合物后续摄取，减少敏感细胞（如原代细胞）因环境骤变导致的效率下降。。在转染GFP报告基因构建体后48h，可通过显微镜和流式细胞仪评价细胞转染效率。

不同细胞类型的用量不一样，需要老师自己优化比例，确定符合自己的实验条件！