TJ-PE的无双链断裂的高效基因敲入系统实验

       关于TJ-PE（Tissue-specific Junction-Polymerase Extension）无双链断裂的高效基因敲入系统的实验原理和设计方案的详细说明：

一、背景与原理
1. 基因敲入技术：旨在将外源基因精确插入到目标基因或特定基因组位置，实现基因功能的研究或疾病模型的建立。
2. 无双链断裂（DSB-free）策略：传统CRISPR-Cas9等技术依赖双链断裂（DSB），可能引起非特异性突变或染色体重排。无双链断裂系统避免这一问题，采用替代机制实现高效、精准的基因插入。
3. TJ-PE系统：结合了组织特异性表达、点对点的连接（Junction）和聚合酶延伸（Polymerase Extension）技术，实现目标基因的高效敲入。

二、实验原理
1. 目标设计：
    设计特异性引导RNA（gRNA）或寡核苷酸，指导系统识别目标基因的特定位点。
    利用组织特异性启动子驱动系统（如肝脏、心脏特异性启动子）实现目标组织内的表达。
2. 连接机制：
    采用“无双链断裂”策略，即通过单链断裂或不依赖DSB的酶切机制，减少非特异性突变。
    引入带有特定连接序列的寡核苷酸或修饰的DNA片段，作为插入模板。
3. 聚合酶延伸：
   利用高效的聚合酶（如Q5或高保真酶）在目标位点进行点对点的DNA合成，将外源DNA插入到目标基因中。
   通过设计的连接序列，确保插入的精确性和定向性。
4. 选择与筛选：
   结合抗性标记或荧光标记筛选成功敲入的细胞或个体。
   使用PCR、测序等验证插入的正确性。

三、设计方案
1. 目标位点选择：
   选择具有功能意义或需要调控的基因区域（如启动子、内含子、外显子）。
2. 连接片段设计：
    设计带有目标序列和连接序列的寡核苷酸或修饰DNA模板。
   -确保连接序列具有高特异性，避免非特异性连接。
3. 转导系统：
    采用病毒载体（如腺相关病毒AAV）或电转、脂质体等方法导入DNA模板和指导RNA。
4. 组织特异性表达：
    使用组织特异性启动子（如Albumin promoter、α-MHC promoter）控制系统中的关键酶或引导RNA的表达。
5. 效率优化：
   通过调节DNA浓度、优化转导条件、使用辅助因子（如单链DNA修复促进剂）提升敲入效率。
6. 验证：
    PCR、测序、荧光显微镜等手段确认目标基因的插入位置和表达情况。

四、实验操作
       包含插入序列及两个引物结合位点（PBS），其中一个PBS与切口sgRNA位点匹配。 TJ-PE可精确插入200 bp和500 bp片段，效率为50.5%和11.4%，并能在细胞中成功插入并表达约800 bp的绿色荧光蛋白（GFP）。TJ-PE为精确基因敲入提供了新的优化方法，尤其适用于小片段的定点敲入，且不引起基因组双链断裂。