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慢病毒产品实验操作手册
人阅读 发布时间：2024-04-17 10:44
慢病毒产品实验操作手册
慢病毒介绍：
慢病毒介绍：
重组慢病毒载体是一种强大而有效的工具， 可以将遗传物质转移到大部分细胞（如分裂细胞、 干细胞、 原代细胞）等的基因组中并维持表达， 具有感染谱广泛、 可以有效感染分裂细胞和非分裂细胞、 长期稳定表达到、源基因等优点。
惺病毒使用曼全注意事顶：
本公司提供的慢病毒颗粒中的毒性基因巴被删除， 属于假型病毒，但该病毒仍具有潜在的危害， 强烈建议不使用能够表达巳知的癌症的假型慢病毒， 使用慢病毒载体前必须充分了解其潜在危害和必要的预防措施。慢病毒为HIV-1假型病毒， HIV属于生物安全级别2的病毒种类， 对人体的危害不言而喻。 慢病毒载体删除了HIV-1的编码基因， 在介导目的基因的表达时， 没有任何的HIV-1蛋臼的表达。 虽然慢病毒载体在世界上各个实验中被广泛应用， 没有报道有任何 不良事件， 但仍具有潜在的产生复制性慢病毒l RCL和致癌风险， 操作者在实验中仍需要保持高度警惕， 所有操作均应按照以下指导执行：
慢病毒对极端温差敏感。 反复冻融和长期暴露于环境温度将降低功能性慢病毒滴度。 本公司提供的慢病毒为50-100 µ LI管， 一假不需要分装。 如果有分装的需要， 收到病毒后立刻于冰上使用预冷的离心管分装病毒（此时可以留存大于35 µ L用于病毒感染前的MOI预实验）。 分装后病毒应存储于－80℃冰箱中。 慢病毒颗粒子－80℃可储存12个月，－20℃储存2个月， 4℃储存一周。 根据本公司的实验结果显示， 在储存期限内， 储存于－20℃的慢病毒未显示出明显的滴度降低现象， 但仍然强烈建议用户将慢病毒储存于－80℃中。根据实验需要， 可使用预冷的完全培养基或PBS稀释慢病毒颗粒， 稀释前于冰上解冻， 并且实验全程请将病毒颗粒置于冰上， 避免过长时间暴露于环境温度中；本公司使用配置的病毒冻存液保存病毒， 因此稀释后的慢病毒请立即使用，不建议再次冻存。
慢病毒感染预实验：
惺病毒使用曼全注意事顶：
本公司提供的慢病毒颗粒中的毒性基因巴被删除， 属于假型病毒，但该病毒仍具有潜在的危害， 强烈建议不使用能够表达巳知的癌症的假型慢病毒， 使用慢病毒载体前必须充分了解其潜在危害和必要的预防措施。慢病毒为HIV-1假型病毒， HIV属于生物安全级别2的病毒种类， 对人体的危害不言而喻。 慢病毒载体删除了HIV-1的编码基因， 在介导目的基因的表达时， 没有任何的HIV-1蛋臼的表达。 虽然慢病毒载体在世界上各个实验中被广泛应用， 没有报道有任何 不良事件， 但仍具有潜在的产生复制性慢病毒l RCL和致癌风险， 操作者在实验中仍需要保持高度警惕， 所有操作均应按照以下指导执行：
1.所有操作应在BSL2级生物安全柜中进行，如在起净台请关闭风机。
2.所有操作人员需要穿是实验服,佩戴一次性口罩和手套， 避免病毒接触口、 眼、 鼻、 耳、 伤口等身体开放性区域。
3.最大限度减少液体飞溅及气溶胶的产生。 实验结束后需要使用1%SDS溶液擦拭干净生物安全柜台面。
4.如需要离心， 应注意使用严密密封的离心管或使用封口膜严密封口后再离心， 防止带有病毒颗粒的液体污染离心机及实验室其他地方。
5.高度注意被污染的尖锐物品， 如刀片、 注射器、 针头、 玻片、 移液管、 毛细玻璃管等。
6.所有接触过病毒的器具， 需要经过消毒液浸泡24h以上或高温高压消毒才可进行下一步处理。
7.实验结束后， 实验人员需使用肥皂及清水标准洗手法清洗双手。
慢病毒的储存厦稀程：
2.所有操作人员需要穿是实验服,佩戴一次性口罩和手套， 避免病毒接触口、 眼、 鼻、 耳、 伤口等身体开放性区域。
3.最大限度减少液体飞溅及气溶胶的产生。 实验结束后需要使用1%SDS溶液擦拭干净生物安全柜台面。
4.如需要离心， 应注意使用严密密封的离心管或使用封口膜严密封口后再离心， 防止带有病毒颗粒的液体污染离心机及实验室其他地方。
5.高度注意被污染的尖锐物品， 如刀片、 注射器、 针头、 玻片、 移液管、 毛细玻璃管等。
6.所有接触过病毒的器具， 需要经过消毒液浸泡24h以上或高温高压消毒才可进行下一步处理。
7.实验结束后， 实验人员需使用肥皂及清水标准洗手法清洗双手。
慢病毒对极端温差敏感。 反复冻融和长期暴露于环境温度将降低功能性慢病毒滴度。 本公司提供的慢病毒为50-100 µ LI管， 一假不需要分装。 如果有分装的需要， 收到病毒后立刻于冰上使用预冷的离心管分装病毒（此时可以留存大于35 µ L用于病毒感染前的MOI预实验）。 分装后病毒应存储于－80℃冰箱中。 慢病毒颗粒子－80℃可储存12个月，－20℃储存2个月， 4℃储存一周。 根据本公司的实验结果显示， 在储存期限内， 储存于－20℃的慢病毒未显示出明显的滴度降低现象， 但仍然强烈建议用户将慢病毒储存于－80℃中。根据实验需要， 可使用预冷的完全培养基或PBS稀释慢病毒颗粒， 稀释前于冰上解冻， 并且实验全程请将病毒颗粒置于冰上， 避免过长时间暴露于环境温度中；本公司使用配置的病毒冻存液保存病毒， 因此稀释后的慢病毒请立即使用，不建议再次冻存。
慢病毒感染预实验：
1确定抗生素筛选的使用浓度
根据实验目的及实验需要， 如需要对感染病毒的细胞进行筛选， 需要确定该细胞适用的抗生素浓度。 常用的真核抗性有：瞟岭霉素、 潮霉素B、 杀稻瘟菌素及遗传霉素。下表为常用的真核抗性及其筛选周期及一般工作浓度。
a) DayO：将细胞铺至24孔板， 根据不同细胞的生长速度， 控制细胞接种量使得次日细胞密度 达到 80%左右。
b} Day1：加入不同浓度的抗生素｛此处以瞟岭霉素为例） ：
c) Day3加入抗生素48h后， 显微镜观察细胞状态：将全部细胞杀死的最低浓度即为该细胞适用的抗生素工作浓度。
根据实验目的及实验需要， 如需要对感染病毒的细胞进行筛选， 需要确定该细胞适用的抗生素浓度。 常用的真核抗性有：瞟岭霉素、 潮霉素B、 杀稻瘟菌素及遗传霉素。下表为常用的真核抗性及其筛选周期及一般工作浓度。
a) DayO：将细胞铺至24孔板， 根据不同细胞的生长速度， 控制细胞接种量使得次日细胞密度 达到 80%左右。
b} Day1：加入不同浓度的抗生素｛此处以瞟岭霉素为例） ：
c) Day3加入抗生素48h后， 显微镜观察细胞状态：将全部细胞杀死的最低浓度即为该细胞适用的抗生素工作浓度。
注意事项1：抗生素筛选时建议每天更换新的培养基并加入抗生素。
注意事项2：抗生素筛选时严格控制细胞密度， 细胞汇合度不能超过100%。
2.确定MOI值
MOI是Multiplicit of Infection的缩写， 中文为感染复数或复感染指数， 其含义是 感染时病毒与细胞数量的比值， 即平均感染每个细胞病毒活性单位数（ TU numbe『／cell）。 MOI取决于多种因素， 如细胞种类、 细胞状态、 目的基因大小等。因此， 实验前需了解慢病毒对靶细胞的亲嗜性、 感染效率、 MOI范围等， 可以通过查阅文献或预实验摸索合适的MOI值。 实际上， 由于不同的细胞来源、 细胞代数 、 细胞状态、 目的基因等差异因素， 实际的MOI也会与文献有差异。 所以在正式实验前进行慢病毒感染靶细胞的最佳MOI及感染条件摸索是很必要的。 一般， 慢病毒感染某种细胞的感染效率达到80%时的MOI值视为最佳MOI 值。
a）感染前24 h：用腹酶消化目的细胞并计数， 调整细胞浓度为3～5 x 104 cells/ml接种到96孔板， 不少于12个孔， 培养基体积为1OOul a病毒感染时的细胞汇合度30-50%。
b} MOI 值的设置若有文献参考， 可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值；若无文献参考可按10倍稀释设置为100 、 10、 1， 每个梯度3次重复。
c) 感染当天：准备2个无菌的1.5 ml离心管， 分别 加入45µ LDMEM。 吸取5µL的1×109 TU/ml的病毒（预先从－80℃取出在冰上融化）加入到第一个管中， 轻柔混匀，不要产生过多气泡；再从从第一管中吸取5µ U昆匀后的病毒 到第二个管中， 同样混匀。 于是第1个管中的病毒 滴度为1×108 TU/ml， 而第2 个管中的滴度为1×107 TU/ml。
d）取10 µ L 1 x 109TU/ml的病毒（预先从一80℃取出在冰上融化）加入第一 组的相应孔中；取10µ L上一步骤制备 的两个不同浓度病毒稀释液加到各组的相应孔中；由此， 三组加入的病毒量分别为1 x 107 TU , 1 x 106TU , 1 x 105TU ， 而细胞经过生长，此时细胞数 目约1×105，所以三个孔的MO！分别为 100、 10、 1。
e）在水平方向轻轻拍打培养板， 使培养基和病毒等试剂充分混匀， 然后把细胞板放回培养箱孵育。
f）感染72小时后， 观察荧光表达情况， 通过荧光率 ， 确认病毒感染目的细胞的最佳MOI值， 同时对感染难易程度及感染时间作出判断。 一般选择感染效率为80%且细胞状况良好的MOI为该细胞的适用MOI。
g） 对于生长缓慢代谢慢的细胞， 可以适当延长观察时间， 中途可以换液， 保持细胞的活性。 以下为部分常见细胞系MOI数值， 数据来源文献。 由于不同实验室细胞状态均不相同，MOI值存在一定差异， 以下 数据仅供参考。
《常见细胞MOI及感染条件》是根据基因修饰项目中积累的MOI值和 Puromycin浓度， 表中暂无的细胞可根据荧光对照病毒梯度稀释后感染目的细胞或文献报道进行筛选。
3.辅助试剂的选择
Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染， 但在少数情况下它对细胞有伤害。 有的细胞对Polybrene的毒理反应明显， 因此细胞感染时是否适合Polyb「ene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同， 可以用1 ～ 10 µ g/ml的范围筛选合适的浓度， 以24h 内细胞无明显毒性反应为佳， 过长时间暴露于Polybrene可对某些细胞产生毒性作用。 可参考文献并进行预实验摸索， Polybrene最常用的工作浓度为6 ～ 8 µ g/ml。 一般我们推荐使用浓度为8 µ g/ml。如果细胞 MOI 值比较低或者对感染效率要求不高， 建议不加任何感染辅助试剂。
2.确定MOI值
MOI是Multiplicit of Infection的缩写， 中文为感染复数或复感染指数， 其含义是 感染时病毒与细胞数量的比值， 即平均感染每个细胞病毒活性单位数（ TU numbe『／cell）。 MOI取决于多种因素， 如细胞种类、 细胞状态、 目的基因大小等。因此， 实验前需了解慢病毒对靶细胞的亲嗜性、 感染效率、 MOI范围等， 可以通过查阅文献或预实验摸索合适的MOI值。 实际上， 由于不同的细胞来源、 细胞代数 、 细胞状态、 目的基因等差异因素， 实际的MOI也会与文献有差异。 所以在正式实验前进行慢病毒感染靶细胞的最佳MOI及感染条件摸索是很必要的。 一般， 慢病毒感染某种细胞的感染效率达到80%时的MOI值视为最佳MOI 值。
a）感染前24 h：用腹酶消化目的细胞并计数， 调整细胞浓度为3～5 x 104 cells/ml接种到96孔板， 不少于12个孔， 培养基体积为1OOul a病毒感染时的细胞汇合度30-50%。
b} MOI 值的设置若有文献参考， 可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值；若无文献参考可按10倍稀释设置为100 、 10、 1， 每个梯度3次重复。
c) 感染当天：准备2个无菌的1.5 ml离心管， 分别 加入45µ LDMEM。 吸取5µL的1×109 TU/ml的病毒（预先从－80℃取出在冰上融化）加入到第一个管中， 轻柔混匀，不要产生过多气泡；再从从第一管中吸取5µ U昆匀后的病毒 到第二个管中， 同样混匀。 于是第1个管中的病毒 滴度为1×108 TU/ml， 而第2 个管中的滴度为1×107 TU/ml。
d）取10 µ L 1 x 109TU/ml的病毒（预先从一80℃取出在冰上融化）加入第一 组的相应孔中；取10µ L上一步骤制备 的两个不同浓度病毒稀释液加到各组的相应孔中；由此， 三组加入的病毒量分别为1 x 107 TU , 1 x 106TU , 1 x 105TU ， 而细胞经过生长，此时细胞数 目约1×105，所以三个孔的MO！分别为 100、 10、 1。
e）在水平方向轻轻拍打培养板， 使培养基和病毒等试剂充分混匀， 然后把细胞板放回培养箱孵育。
f）感染72小时后， 观察荧光表达情况， 通过荧光率 ， 确认病毒感染目的细胞的最佳MOI值， 同时对感染难易程度及感染时间作出判断。 一般选择感染效率为80%且细胞状况良好的MOI为该细胞的适用MOI。
g） 对于生长缓慢代谢慢的细胞， 可以适当延长观察时间， 中途可以换液， 保持细胞的活性。 以下为部分常见细胞系MOI数值， 数据来源文献。 由于不同实验室细胞状态均不相同，MOI值存在一定差异， 以下 数据仅供参考。
《常见细胞MOI及感染条件》是根据基因修饰项目中积累的MOI值和 Puromycin浓度， 表中暂无的细胞可根据荧光对照病毒梯度稀释后感染目的细胞或文献报道进行筛选。
3.辅助试剂的选择
Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染， 但在少数情况下它对细胞有伤害。 有的细胞对Polybrene的毒理反应明显， 因此细胞感染时是否适合Polyb「ene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同， 可以用1 ～ 10 µ g/ml的范围筛选合适的浓度， 以24h 内细胞无明显毒性反应为佳， 过长时间暴露于Polybrene可对某些细胞产生毒性作用。 可参考文献并进行预实验摸索， Polybrene最常用的工作浓度为6 ～ 8 µ g/ml。 一般我们推荐使用浓度为8 µ g/ml。如果细胞 MOI 值比较低或者对感染效率要求不高， 建议不加任何感染辅助试剂。
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