石蜡切片 DABtunel 实验操作步骤

石蜡切片 DABtunel 实验操作步骤：
1 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水
乙醇Ⅱ 5min-85%酒精 5min-75%酒精 5min-蒸馏水洗。
2 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K
工作液覆盖组织，37 度温箱孵育 20min。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗
涤 3 次，每次 5min。
3（可选步骤）破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，
将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。
4 阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每
次 5min。切片放入 3%双氧水溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在
脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。
5 室温平衡：切片稍甩干后在圈内滴加 buffer 覆盖组织，buffer 常温孵育 10min.
6 加反应液： 去掉平衡液，Recombinant TdT enzyme：Biotin-dUTP Labeling Mix：Equilibration
Buffer=1 µL：5 µL：50 µL 比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育 1
小时，湿盒内加少量水保持湿度。
7 加 Streptavidin-HRP 反应液：将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，
每次 5min。 Streptavidin-HRP 和 TBST 按 1：200 比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放
于湿盒内，37℃温箱孵育 30min。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，
每次 5min。
8 DAB 显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，
阳性为细胞核呈棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。
9 复染细胞核：苏木素复染 1min 左右，纯水洗涤，分化液分化数秒，纯水洗涤，
氨水返蓝，纯水冲洗。
10 脱水封片：将切片经 4 缸 100%酒精脱水，每缸 5min, 随后在正丁醇中浸泡 5min,
放入二甲苯中进行透明，时间 5min 以上，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

2.结果判断
苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色